肝癌分子与免疫分型及免疫联合靶向治疗研究

作者：邢同京

文章来源：中华肝胆外科杂志,,27(7)

摘要

原发性肝癌具有高度异质性，不同患者甚至同一肝癌组织内部的分子特征明显不同。目前的临床和病理学分型不能准确评估肝癌的异质性，随着肝癌基因组学、蛋白质组学以及代谢组学等多组学研究和技术的发展，肝癌的分子分型取得了较大进展，而肝癌免疫微环境的深入研究推动了肝癌免疫分型的认识，但是目前均未能转化为指导临床实践的策略。免疫联合抗血管生成靶向药物治疗晚期肝癌患者取得重大突破，正在成为晚期甚至中期肝癌患者的一线治疗手段。本文对有关原发性肝癌的分子和免疫分型以及免疫联合抗血管生成靶向药物治疗方面的研究进展进行阐述。

一、原发性肝癌的分子分型

在肝脏癌变过程中，多个癌基因和抑癌基因发生突变。通过全基因组测序分析，在HCC组织细胞中个基因带有非沉默突变，其中26个基因被确定为显著突变基因。在高达44%的肿瘤中发现端粒反转录酶(TERT)基因启动子突变，在31%的肿瘤中发现TP53基因突变，在27%的肿瘤中存在CTNNB1基因突变，其他潜在的治疗靶点包括血管内皮生长因子A(vascularendothelialgrowthfactorA，VEGFA)、异柠檬酸脱氢酶1等。尽管TERT、TP53、CTNNB1等基因在肝癌中已被证实为高频突变基因，但其在肝癌发生发展过程中是发挥驱动基因还是"过客"基因作用仍未明确。

近年来，一些学者基于HCC的基因突变与临床特征，相继提出了多种HCC的分子分型方案。Boyault等根据P53、PIK3CA、Wnt/β-联蛋白(β-catenin)等基因突变、乙型肝炎病毒(HBV)拷贝数、胎肝基因表达水平等，提出了与肝癌临床和遗传特征相关的G1-G6分型方案。

Hoshida等根据Wnt/β-catenin和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路激活情况、MYC和EpCAM基因表达水平、甲胎蛋白水平，提出了基于基因表达谱的S1-S3分型方案。Schulze等根据外显子突变特征，将HCC分为6个基因突变特征组，与病因学和分子特征显著相关。分析3组突变基因与危险因素的相关性，CTNNB1与酒精性肝癌明显相关、TP53与HBV型肝癌明显相关。根据肿瘤进展分期分析，TERT启动子突变为早期事件，而FGF3、FGF4、FGF19或CCND1扩增和TP53、CDKN2A改变则出现在侵袭性肿瘤的晚期。通过对HCC基因表达谱累积分析以及与其他分子信息的整合，Zucman-Rossi等将肝癌分为增殖型和非增殖型，2个亚型分别约占肝癌的50%。增殖型肝癌以细胞增殖及生存相关的信号通路激活为主要特征，染色体不稳定性增加，伴有TP53失活、FGF19和CCND1扩增显著增加。增殖型肝癌又可分为Wnt/转化生长因子(TGF)-β型和祖细胞型。非增殖型肝癌至少包括3个亚型，以经典Wnt信号通路激活及TERT启动子突变为特征。从临床角度看，增殖型肝癌与HBV相关，预后一般较差，而非增殖型肝癌主要与酒精及丙型肝炎病毒相关，预后较好。

随着肝癌多组学研究技术的进展，年癌症基因组图谱研究组通过综合分子分型，整合了DNA拷贝数、DNA甲基化、信使RNA表达、微小RNA表达、反向蛋白芯片的数据，进行无监督聚类分析，确定了肝癌的3个分子亚型iCluster1(iC1)、iCluster2(iC2)和iCluster3(iC3)。研究者基于基因表达建立了上述分子分型的预测模型，并在3个已发表的外部肝癌患者队列的数据集上进行验证，结果显示iC1的预后比iC2和iC3更差。Gao等收集例手术切除的肝癌标本，首次对HBV相关的HCC进行了蛋白质基因组分析，揭示了HBV相关性肝癌中关键信号通路的激活状态以及肝脏特异性代谢重编程。

该研究提出将肝癌分为3个亚型，即代谢驱动型、微环境失调型和增殖驱动型。3个亚型患者的临床预后和潜在治疗靶点显著不同，其中代谢驱动型疗效最好，增殖驱动型疗效及预后最差。Shimada等通过对2个组学数据集的综合分子评估，确定了肝癌的3个主要亚型：(1)有丝分裂性和干细胞样肿瘤，染色体不稳定；(2)CTNNB1基因突变肿瘤显示免疫抑制；(3)代谢性疾病相关肿瘤，包括以巨噬细胞浸润和良好预后为特征的免疫原性亚群。并阐明该分类与临床病理因素、免疫特征和复发密切相关。

上述分型在一定程度上反映HCC患者的预后及对治疗的应答，但是相对肺癌、乳腺癌、胃癌等常见肿瘤，这些分型方案指标众多，操作复杂，未能在临床推广应用，不能满足临床精准治疗的需求。因此，高通量测序、大规模的基因突变检测并未解决肝癌精准诊疗面临的新挑战，还有很多问题有待突破，例如如何解读与分析数据、如何将数据应用于肿瘤诊疗等。此外，这些分型主要是基于肿瘤细胞内在的分子变化，缺乏肿瘤微环境的特征，综合其基因和微环境特征的评估体系更能反映HCC的生物学特性和预后。

二、原发性肝癌的分子免疫分型

肿瘤微环境对HCC的进展，尤其是浸润性基质细胞和免疫细胞有明显影响。研究表明，肿瘤微环境组分在预测预后和疗效方面具有重要价值。但肿瘤免疫微环境的免疫细胞组成及其与组织学表现的关系仍不清楚。此外，尚不清楚哪种免疫细胞或免疫微环境最具有预测意义。Kurebayashi等综合分析了例HCC患者肝组织个不同区域的免疫微环境及其瘤内异质性，并与相应的组织学和预后资料进行了比较，观察到不同分期肝癌患者的肿瘤组织内免疫微环境存在异质性，提出将肝癌的免疫微环境分为3个亚型：免疫高水平、免疫中水平、免疫低水平。

免疫高水平亚型以B细胞或者浆细胞和T细胞浸润增加为特征，免疫高水平亚型和B细胞浸润为预后良好的独立预测因素，免疫高水平亚型肝癌患者预后明显优于免疫中低水平患者。这些结果为评价HCC的免疫微环境提供了理论基础。原发性HCC常发生于慢性炎症中，Yarchoan等研究结果表明，在多数肝癌组织中，参与CD8+T细胞耐受的2个蛋白淋巴细胞活化基因3(lymphocyteactivationgene3，LAG-3)和程序性死亡蛋白配体-1(programmeddeathligand-1，PD-L1)表达增加，为联合应用LAG-3和PD-L1抑制剂进行阻断治疗提供依据。

Sia等基于肿瘤免疫微环境，提出将肝癌分为免疫型、免疫中间型和非免疫型。免疫型有较多的免疫细胞浸润、干扰素-γ信号通路激活及程序性死亡蛋白-1(PD-1)/PD-L1表达，缺乏CTNNB1基因突变，可进一步分为免疫激活和免疫耗竭2种，分别以获得性T细胞激活及免疫耗竭为特征。其中免疫耗竭型表达多种TGF-β调节的基因，介导免疫抑制及T细胞衰竭。非免疫型肝癌的主要特征为肿瘤微环境中的T细胞缺失及CTNNB1基因突变。有研究检测了例肝癌患者的组织，22%的肿瘤有中高水平的淋巴细胞浸润。通过66个免疫标志物基因表达的无监督聚类鉴别出了6类肿瘤标本，其中High1和High2类显示细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)、CD(PD-1)和CD(PD-L1)等在内的免疫标志物高表达，提示可能有部分患者对免疫治疗敏感。多数HCC是在肝硬化和慢性炎症基础上发病。

Moeini等分析了早期HCC患者的癌旁肝组织和肝硬化患者的肝组织，确定了个可能有助于肝癌发病的免疫反应失调的基因，称之为免疫介导的癌症领域(immune-mediatedcancerfield，ICF)。ICF基因在50%的肝硬化患者肝组织和60%的早期HCC患者癌旁肝组织中表达。表达ICF基因的肝组织具有3个特征：效应T细胞数量增加、抑制免疫应答和TGF-β信号活化的基因表达增加、促进炎症和激活干扰素γ信号的基因表达。肝硬化患者和具有免疫抑制特征的肝组织患者均具有较高的患肝癌风险。

免疫分型与多组学的分子分型有重合之处，其中免疫耗竭型与增殖型中S1型大致重合，而非免疫型与CTNNB1基因突变的非增殖型重合。然而，这些新的HCC分类目前尚未形成一个统一的可转化的临床共识。Désert等回顾了HCC分类的分子数据，利用这些数据从3个主要维度解释HCC的异质性或表型多样性。第一个维度，根据肿瘤细胞的增殖和分化将HCC分为两大类，表现出不同的临床侵袭性。第二个维度，肝癌微环境和肿瘤免疫是延长患者生存期的基础。第三个维度，代谢基因重编程，随着最近特异性代谢谱亚型的建立，可能将产生更加适合的联合治疗方法。

三、HCC的分子与免疫靶向治疗

近年来，肝癌的分子靶向治疗取得了进展，继索拉非尼之后，乐伐替尼、瑞戈非尼等相继被批准用于肝癌的一线和二线治疗。同时，针对免疫检查点的抑制剂，包括抗CTLA-4、PD-1和PD-L1抗体，已被批准用于肝癌治疗，但是相关研究显示其客观缓解率仍十分有限，仅有少数患者获益，这可能与肝癌的低免疫原性或抑制性免疫微环境有关。鉴于2类药物单独应用的疗效并不理想，有研究开始应用免疫检查点抑制剂联合局部治疗或其他分子靶向药物治疗肝癌，效果较好。

免疫联合治疗已成为肝癌系统治疗的新方向，尤其是分子靶向药物联合免疫治疗，不仅获得更优的疗效且不良反应较轻。研究表明，免疫与靶向联合治疗增加HCC模型小鼠CD8+T细胞的活化和浸润，改变肿瘤相关巨噬细胞的M1/M2比例，减少肝癌组织中的调节性T细胞和单核细胞浸润，重塑免疫微环境。靶向药物与靶点结合抑制肿瘤细胞的生长，还可以影响人体的免疫反应，包括增强肿瘤细胞的抗原性，以及促进T细胞迁移至肿瘤内部。而免疫治疗可通过改善肿瘤细胞对免疫细胞识别的抑制作用，增强患者对肿瘤的免疫杀伤功能。

研究表明，免疫抑制剂阿特珠单抗联合血管内皮生长因子抑制剂贝伐珠单抗治疗进展期肝癌安全且耐受性好，能够改善患者的总生存期和无进展生存期。目前，阿特珠单抗联合贝伐珠单抗(T+A)方案、仑伐替尼联合帕博利珠单抗(K+L)组合等免疫联合靶向治疗，已被美国食品和药品管理局授予晚期HCC的突破性疗法。一项多中心临床Ⅲ期试验，入组了例HCC患者，按照2∶1的比例分配到T+A联合治疗组和索拉非尼单药治疗组。T+A方案使患者无进展生存期延长，T+A组患者1年生存率达到67.2%。Finn等研究表明，仑伐替尼联合帕博利珠单抗治疗不可切除肝癌患者的客观缓解率为46%，其中11%患者达到完全缓解，中位无进展生存期为9.3个月，中位生存期为22个月。我国自主研发的卡瑞利珠单抗联合阿帕替尼，也在肝癌患者治疗中取得了初步效果，16例肝癌患者的治疗有效率达50%。目前正在进行Ⅲ期临床研究，结果值得期待。

尽管免疫联合靶向治疗取得了较好的效果，但是如何筛选出应答患者并实时动态监测疗效，是其面临的重要问题。有研究者使用流式细胞术对接受索拉非尼或PD-1/PD-L1阻断剂治疗的肝癌患者进行免疫监测，结果表明，索拉非尼治疗应答组患者肿瘤内PD-1highCD8+T细胞的基线比率明显低于无应答患者，循环PD-1+T细胞的比率随患者肿瘤的进展而增加。相反，PD-1/PD-L1阻断剂治疗应答组患者肿瘤内PD-1highCD8+T细胞的基线比率高于无应答患者。此外，还观察到PD-1/PD-L1阻断剂治疗无应答患者循环T细胞LAG3和TIM3表达上调。提示肿瘤内PD-1highCD8+T细胞的比率可以作为指导应用索拉非尼或PD-1/PD-L1阻断剂的一个生物标志物，并支持应用联合治疗的策略。

总之，随着肝癌多组学研究和技术的发展，肝癌的分子分型已经取得了很大进展。但是肝癌的分子分型指标还比较复杂，缺乏统一性，未能用于指导临床实践。肝癌免疫微环境的深入研究推动了肝癌免疫学分型的认识，免疫联合抗血管生成药物等治疗已经在晚期肝癌患者中获得了良好的效果，正在成为晚期甚至中期肝癌患者的一线治疗手段。未来研究需要探讨分子与免疫靶向联合治疗与其他肝癌治疗手段优化组合的策略，以及指导联合治疗的分子标志物，以期最大限度的发挥分子与免疫靶向联合治疗的潜力，从而使原发性肝癌患者获益。

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