//背景
胆管癌(CCA)是一种起源于胆管系统不同部位的上皮细胞恶性肿瘤，特点是胆管细胞分化标记物。CCA的高度促纤维变性和深厚的遗传异质性导致其耐药。目前迫切需要对CCA的治疗靶点和有效药物进行鉴定和开发。本文报道了建立CCAPDXs和PDX衍生细胞(PDCs)的生物样本库，将其扩展并用于药物筛选和验证。利用PDX和PDC生物技术鉴定了PTEN作为CCA和其他类型癌症中蛋白酶体抑制剂的分层标记物。
//研究结果
结果1.药物筛选显示蛋白酶体抑制剂硼替佐米对已建立的CCAPDCs和细胞系有选择性的疗效
处理来自不同患者的44个新鲜CCA标本，并建立34个PDX模型，病理评估后，使用PDXs和PDCs进行药物筛选和分子图谱分析，可找到个性化的治疗方法和治疗机制。组织学分析显示，PDXs与其亲本活检的形态学相似，CCA标记物CK19的免疫组化(IHC)和免疫荧光(IF)染色显示即使分离成单细胞并在二维培养中生长，PDXs也能保持这种标记。蛋白酶体抑制剂硼替佐米和卡非佐米对PDCs显示出明显的细胞毒性作用。硼替佐米在其IC50浓度下对所有PDCs均有较强的抑制作用，且这种抑制作用可扩展到其他蛋白酶抑制剂。
图1
结果2.硼替佐米敏感细胞株和PDCs缺乏PTEN基因表达
对两种代表性细胞系HCCC-(敏感)和RBE(不敏感)的转录组分析显示，在硼替佐米敏感细胞系HCCC-中，丝裂原激活蛋白激酶、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-AKT和泛素介导的蛋白水解通路均上调。通过对这两种细胞系的全基因组测序(WGS)数据库的调查发现PTEN基因有缺失。细胞系分析发现，HCCC-中PTEN基因深度缺失，而在HuCCT1和TFK1中拷贝数缺失。PTEN变化只发生在硼替佐米敏感细胞，它们具有较高的蛋白酶体活性和蛋白质合成率。在正常培养条件下和硼替佐米治疗后，PTEN改变的细胞系具有较低的细胞保护应激反应活性，表明PTEN调节HSF1介导的应激反应。PTEN缺陷细胞具有较低的氧化还原状态，表明ER中蛋白质折叠能力下降。PTEN缺失细胞具有高蛋白质周转的速度，这将支持高扩散率，通过阻断蛋白酶体或诱导细胞内质网应激而引起的蛋白酶抑制紊乱将会导致致命的后果。
图2
结果3.PTEN的恢复触发坏死性凋亡，并损害PTEN缺乏的CCAPDXs的增殖
在RBE(PTEN完整)和HCCC-(PTEN缺失)细胞中诱导腺病毒介导的PTEN过表达(Ad-PTEN)。类似硼替佐米治疗，HCCC-细胞中PTEN恢复强烈抑制细胞增殖，减少生存能力，诱导细胞凋亡，而Ad-PTEN只有轻微影响RBE细胞。在PTEN缺失PDX肿瘤内Ad-PTEN减少细胞增殖，肿瘤出现大面积坏死。
结果4.PTEN缺乏增加了蛋白酶体的蛋白水解活性，促进了硼替佐米在CCA中的治疗效果
测定表达PTEN的腺病毒感染RBE和HCCC-细胞的基因表达谱，蛋白酶体和泛素介导的蛋白水解通路在HCCC细胞中受到特异性影响。在PTEN完整的细胞株中，PTEN敲低增加了蛋白酶体活性，而在PTEN缺失的细胞株HCCC-中没有影响。过表达PTEN降低了PTEN缺失细胞系中的蛋白酶体活性。在PTEN缺失PDXs中硼替佐米治疗有效的抑制肿瘤生长和在孤立PTEN缺失PDCs中减少细胞增殖。
图3
图4
结果5.PTEN缺陷的CCA小鼠和患者对硼替佐米治疗反应改善
使用两个成熟的小鼠模型-遗传工程的本地CCA模型(AKPP)和硫代乙酰胺(TAA)诱导的CCA模型来评估PTEN状态是否有助于硼替佐米的敏感性，与TAA诱导的AK模型中的PTEN完整细胞相比，AKPP模型衍生的PTEN缺陷肿瘤细胞对硼替佐米更敏感，并具有更高的蛋白酶体转录和蛋白水解活性。随后建立了一项临床试验来验证蛋白酶体抑制剂是否可以改善一线治疗失败的CCA患者的预后。低剂量硼替佐米有抗肿瘤作用，与单独使用吉西他滨相比，硼替佐米和吉西他滨联合使用的抗肿瘤效果更好。这些临床数据有力地支持了临床前研究，并表明了很有前途的转译可能性。
图5
结果6.PTEN独立于NRF1和NRF2调节蛋白酶体基因表达
NRF1和NRF2被认为是蛋白酶体基因转录的关键调控因子，NRF1和NRF2的过表达促进了HuCCT1细胞中糜蛋白酶样蛋白水解活性。NRF1过表达也促进了HuCCT1细胞中泛素的降解。PTEN已被报道通过糖原合酶激酶3(GSK-3)或AKT抑制人红细胞白血病细胞和小鼠肝脏中NRF依赖的抗氧化通路。然而，PTEN过表达或敲低在PTEN完整(RBE)或PTEN半合子缺失(HuCCT1)CCA细胞中对NRF1或NRF2的表达、核易位、积累或降解影响不大。这些结果表明PTEN独立于NRF1和NRF2抑制蛋白酶体亚基转录。
结果7.PTEN通过BACH1和MAFF抑制蛋白酶体活性
在CCA细胞系中，当PTEN过表达时，BACH1和MAFF的转录持续增加，而当PTEN敲低时，BACH1和MAFF的转录持续下降。表明BACH1和MAFF是参与PTEN和蛋白酶体功能关系的候选基因。BACH1是一种普遍存在的因子，缺乏典型的转录激活域，从而抑制转录。MAF是一种小型MAF蛋白。当MAFF与CNC家族转录因子形成异二聚体时，该复合物充当转录激活因子，MAFF同型二聚体可作为阻遏物。PTEN过表达增加了BACH1和MAFF启动子活性，PTEN通过影响PI3K-AKT通路促进BACH1和MAFF的表达。PTEN过表达和MK处理增加了BACH1和MAFF的核易位。在HuCCT1或TFK1细胞中过表达BACH1或MAFF降低了报告基因依赖的转录和糜蛋白酶样蛋白酶体的蛋白水解活性。BACH1和MAFF过表达抑制了PTENsiRNA诱导的蛋白酶体激活和对硼替佐米细胞毒性的敏感性。在人CCA样本中，PTEN表达与BACH1和MAFF呈正相关。
图6
结果8.PTEN-PI3K-AKT-FOXO1通路调节BACH1和MAFF的表达和蛋白酶体活性
在FOXO家族成员的BACH1和MAFF启动子中发现了结合位点，这些位点被AKT抑制。通过芯片检测验证了FOXO1和FOXO3与BACH1和MAFF启动子的结合，PTEN或MK在PTEN缺陷的HCCC-细胞中瞬时表达增加了FOXO1的核转位。此外，PTEN促进了FOXO1在HuCCT1细胞中的BACH1和MAFF启动子的募集。BACH1是由蛋白酶体翻译后调节的，BACH1和MAFF以及蛋白酶体的蛋白水解活性受到PTEN-PI3K-AKT-FOXO1轴的调控。与PTEN完整细胞相比，PTEN缺陷细胞具有更高的蛋白质合成率和蛋白酶体活性，使这些细胞呈现高的蛋白质转化率。用蛋白酶体抑制剂阻断蛋白质降解导致细胞形成聚合体并经历蛋白毒性应激，从而导致细胞死亡。
图7
结果9.PTEN状态调节对蛋白酶体抑制剂的敏感性在人类癌症中是普遍的
GDSC数据库分析显示，来自消化系统或神经系统的PTEN突变癌细胞株对蛋白酶体抑制剂硼替佐米和MG-比PTEN完整癌细胞株更敏感。相比之下，PTEN状态对血液和泌尿生殖系统癌细胞株的敏感性无显著影响。进一步分析CTRP的卵巢癌数据显示，PTEN突变和低表达的细胞比WTPTEN或PTEN扩增的细胞对硼替佐米治疗更敏感。具有PTEN扩增基因的COV对硼替佐米表现出最高的耐药性。通过TCGA数据库分析，发现前列腺癌伴PTEN改变显著增加了蛋白酶体亚基的表达。在多种人类癌症中，PTEN状态调节了肿瘤细胞对蛋白酶体抑制剂的敏感性。
图8
//结论
在CCA的共临床试验中，有限的证据表明PDXs和PDCs具有预测药物反应的潜力。与细胞系筛选或基因型引导筛选相比，PDCs和PDXs的结果在识别可能的治疗选择方面可能更可靠和有效。通过PDX和PDC生物技术，发现蛋白酶体抑制剂在所有的CCA筛选试验中发挥了广泛的功效。通过进一步的检测，发现硼替佐米敏感细胞株具有更高的蛋白酶体蛋白水解活性。分子谱分析提示肿瘤抑制基因PTEN与CCA中硼替佐米的敏感性有关。通过功能验证，发现PTEN抑制了蛋白酶体活性，削弱了硼替佐米的疗效。PTEN改变的细胞株显示出高的蛋白酶体活性和增殖，这导致了在体外和体内对蛋白酶体抑制剂的敏感性。PTEN可能调节蛋白酶体的功能，通过siRNA筛选，发现ARE相关的转录抑制子BACH1和MAFF参与了PTEN介导的蛋白酶体抑制。FOXO1是BACH1和MAFF的关键转录调控因子。蛋白酶体活性是PTEN缺乏的CCA肿瘤的主要治疗靶点。PTEN-AKT-FOXO1-BACH1/MAFF通路介导蛋白酶体基因的转录抑制，并对硼替佐米治疗产生耐药性。PTEN缺乏导致了蛋白酶体对多种癌症的抑制的治疗脆弱性，该方法值得进一步临床验证。
//原文信息
本文于年12月23日发表于杂志Sci.Transl.Med，第一作者是TianYiJiang，Yu-FeiPan，Zheng-HuaWan，通讯作者是LiWeiDong，YeXiongTan，HongYangWang，通讯单位为第二军医大学。
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